革蘭氏染色液染色法是細菌學中zui廣泛使用的一種鑒別染色法。1884 年 由丹麥醫(yī)師 Gram 創(chuàng)立。方法是先將細菌用結晶紫染色,加媒染劑(增加染料和細胞的親和力)后,用脫色劑(酒精或丙酮)脫色,再用復染劑染色。如果細菌 不被脫色而保存原染液顏色者為革蘭陽性菌(G+);如被脫色,而染上復染液的顏 色者為革蘭陰性菌(G-)。此染色法可將所有具有細胞壁的細菌分為兩大類:革蘭 陽性菌和革蘭陰性菌。
單染色法:只能觀察微生物的大小、形狀、和細胞排列狀況,但不能鑒別微生物以及它的特殊構造等。
復染色法:用兩種或兩種以上染色液進行染色,有協(xié)助鑒別微生物的作用,故也稱鑒別染色法。常用的有:革蘭氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。
染色原理: 現(xiàn)在認為細菌對革蘭染色的不同反應主要是革蘭陽性菌和陰性菌 的細胞壁結構與化學組成不同。革蘭陽性菌的細胞壁較厚,肽聚糖含量多,且交 聯(lián)度大,脂類含量少,經(jīng)95%乙醇脫色時,肽聚糖層的孔徑變小,通透性降低,與細胞結合的結晶紫與碘的復合物不易被脫掉,因此細胞仍保留初染時的顏色。而革蘭陰性菌的細胞壁較薄,含有較多的類脂質(zhì),而肽聚糖的含量較少,乙醇脫 色時溶解外層類脂質(zhì),增加了細胞壁的通透性,使初染的結晶紫和碘的復合物易 于滲出,結果細胞被脫色,經(jīng)復染后,又染上復染的顏色。
1. 革蘭氏染色
(1)涂片
(2)初染:在做好的涂面上滴加草酸銨結晶紫染液,染1分鐘,傾去染液,流水沖洗至無紫色。
(3)媒染:先用新配的路哥氏碘液沖去殘水,而后用其覆蓋涂面1分鐘,后水洗。
(4)脫色:除去殘水后,滴加95%酒精進行脫色約15-20秒,后立即用流水沖洗。
(5)復染:滴加番紅染色液,染3-5分鐘,水洗后用吸水紙吸干。
(6)鏡檢:觀察染色結果并繪圖。
2. 染色過程:涂片(大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)→干燥→固定→初染(結晶 染色過程: 紫染色 1min)→媒染(碘 1min)→水洗→95%乙醇脫色(1min)→復染(番紅花 紅染色 1min)→干燥→鏡檢(油鏡)
3. 油鏡的使用與保養(yǎng)
(1)在需觀察部位的玻片上滴加一滴香柏油,然后慢慢轉動油鏡,在轉 換油鏡時,從側面水平注視鏡頭與玻片的距離,使鏡頭浸入油中而 又不以壓破載玻片為宜。
(2)用雙眼觀察目鏡,并慢慢轉動粗調(diào)節(jié)器至出現(xiàn)模糊物象,然后用細調(diào)節(jié)器至物象清晰為止。
(3)如果不出現(xiàn)物象或者目標不理想要重找。細胞
(4)油鏡使用完畢,先用擦鏡紙沾少許乙醇將鏡頭上和標本上的香柏油 擦去,然后再用干擦鏡紙擦干凈。