(一)免疫熒光組織化學原理
將已知抗原或抗體標記上熒光素,制成熒光抗體,再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原(或抗體)。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素,利用熒光顯微鏡觀察標本,熒光素受到激發(fā)光的照射會發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或橘紅色),熒光素受激發(fā)光照射,由低能態(tài)進入高能態(tài),而高能態(tài)的電子不穩(wěn)定,以輻射光量子的形式釋放能量后,再回到原來的低能態(tài),這時發(fā)出明亮的熒光。利用熒光顯微鏡可觀察熒光所在細胞或組織,從而確定抗原或抗體性質(zhì)和定位,以及利用定量技術測定含量。
(二)熒光抗體染色法
1.直接法
(1)染色:切片經(jīng)固定后,滴加經(jīng)稀釋至染色效價的熒光抗體,在室溫或37℃染色30min。切片置入濕盒內(nèi),防止干燥。
(2)洗片:倒去熒光抗體,將切片浸入pH 7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗兩次,電磁"振動,每次5min,再用蒸餾水洗1min,除去鹽結晶。
(3)50%碳酸鹽緩沖甘油(O.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH 9.O~9.5)封固、鏡檢。
直接法相對簡單,適用于細菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗體如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應抗原,特異性高而敏感性相對低。
2.間接法(雙層法)
(1)切片固定后用毛細管吸取適當稀釋的免疫血清滴在其上,置于濕盒中,37℃作用30min。用O.01mol/LpH 7.2 PBS洗滌兩次,每次5min,用濾紙吸去多余液體。
(2)再滴加問接熒光抗體(如兔抗人γ一球蛋白熒光抗體等),同上步驟,37℃染色30min,PBS洗滌兩次,每次5mirt,振動,緩沖甘油封固,鏡檢。
3.間接法(夾心法)
(1)切片或涂片固定后,置于染色濕盒內(nèi)。
(2)滴加未標記的特異性抗原與切片作用于37℃,30min。
(3)PBS緩沖液洗滌2次,每次5min,吹干。
(4)在切片上滴加特異性熒光抗體,37℃,30 min。
(5)PBS緩沖液洗滌兩次,每次5min,吹干。
(6)緩沖甘油封固,鏡檢。
4.補體方法
(1)材料和方法
1)免疫血清60℃滅活20min,用Kolmers;鹽水作2倍稀釋,為1:2,1:4,1:8…補體用10倍稀釋的新鮮豚鼠血清,抗補體熒光抗體等,按下述補體法染色。免疫血清補體結合效價如為1:32,則免疫血清應用l:8倍稀釋。
2)補體用新鮮豚鼠血清一般作l:10稀釋或按補體結合反應試管法所測定的結果,按兩單位的比例,用K。lmers鹽水稀釋備用。
Kolmers鹽水配制是在pH7.4的0.1mol/L PBS中溶解MgSO4,其終濃度為O.01%。
3)抗補體熒光抗體:在免疫血清效價為1:4,補體為兩單位的條件下,用補體染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價,然后按染色效價1:4的濃度用Kolrners鹽水稀釋備用。
(2)方法
1)涂片或冰凍切片用冷丙酮10min固定和PBS洗滌一次,約3min,吹至組織表面無水分。
2)吸取經(jīng)適當稀釋的免疫血清及補體的等量混合液(此時免疫血清及補體又都各稀釋一倍)滴于切片上,37℃作用30min,置于濕盒內(nèi)。
3)用PBS緩沖液洗滌2次,攪拌或振動混勻,每次5m·n,吸于標本周圍水分。
4)滴加經(jīng)適當稀釋的抗補體熒光抗體,37℃作用30min,水洗同上。
5)蒸餾水洗滌lmin,緩沖甘油封固。
5.膜抗原熒光抗體染色法
用直接法或間接法原理及步驟,可對活細胞在試管內(nèi)進行染色,常于T和B細胞、細貔培養(yǎng)物、瘤細胞抗原和受體等的研究,陽性熒光主要在細胞膜上。
6.雙重染色方法
(1)一步法雙染色法:先將兩種標記抗體按適當比例混合(A+B),按直接方法進行姿色。
(2)二步法雙染色方法:先用RB200標記的B抗體染色,不必洗去,再用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,F(xiàn)ITC)標記的A抗體染色,按間接法進行。
(3)結果:經(jīng)FITC標記的A抗原陽性熒光呈現(xiàn)綠色,經(jīng)RB200標記的B抗原陽性呈現(xiàn)橘紅色熒光。
(三)熒光抗原染色法
某些抗原可用熒光素標記,制成熒光抗原,標記熒光素的方法與制備熒光抗體方法相同:用熒光抗原可直接檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗體,特異性較好,敏感性較差。染色方法與熒光抗體染色的直接染色法相同。由于多數(shù)抗原難以提純或量少昂貴,一般很少采用此法。