研生試劑-FITC(異硫氰酸熒光素)
的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年,是目前應(yīng)用zui廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是人眼對(duì)黃綠色較為敏感,通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。
FITC 是在熒光素的基礎(chǔ)上通過化學(xué)反應(yīng)增加硫氰酸基團(tuán)得到的,硫氰酸基團(tuán)可以和生物活性物質(zhì)例如蛋白質(zhì)上的伯胺基團(tuán)反應(yīng)形成硫脲鍵,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物活性物質(zhì)的熒光標(biāo)記
FITC相關(guān)事項(xiàng)
分子式:C21H11NO5S
分子量:389.38
性質(zhì):
1. 外觀:黃色粉末
2. 純度:≥95% (HPLC)
3. 產(chǎn)品描述:FITC能和各種抗體蛋白結(jié)合,結(jié)合后的抗體不喪失與一定抗原結(jié)合的特異性,并在堿性溶液中具有強(qiáng)烈的黃綠色熒光。通過在熒光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞儀分析可對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位或定量的檢測(cè)。用于醫(yī)學(xué),農(nóng)學(xué)和畜牧等方面,可對(duì)由細(xì)菌病毒和寄生蟲等所致疾病進(jìn)行快速診斷。
4. FITC標(biāo)記抗體流程:
(1)將待交聯(lián)的蛋白(濃度≥1mg/ml)對(duì)交聯(lián)反應(yīng)液透析三次4℃,至pH=9.0。交聯(lián)反應(yīng)液配制方法:7.56g NaHCO3,1.06g Na2CO3,7.36g NaCl,加水定容至1 L。
(2)將FITC溶于DMSO中,濃度為1mg/mL。每次交聯(lián)使用的FITC均應(yīng)新鮮配制,避光。
(3)按P:F(蛋白質(zhì):FITC)=1mg:150μg 的比例將FITC緩慢加入于抗體溶液中,邊加邊輕輕晃動(dòng)使其與抗體混合均勻,暗處4 ℃反應(yīng)8 h。
(4)加入5mol/L的NH4Cl至終濃度50mmol/L, 4 ℃終止反應(yīng)2 h。
(5)將交聯(lián)物在PBS中透析四次以上,至透析液清亮。
(6)交聯(lián)物的鑒定
蛋白濃度(mg/mL) = [ A280– 0.31×A495 ] / 1.4
F/P比例: 3.1×A495 / [A280 – 0.31×A495 ],該值應(yīng)介于2.5 ~ 6.5之間。
(7)FITC交聯(lián)的蛋白應(yīng)置于pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中,加入0.1% NaN3、1% BSA,4℃避光保存。 儲(chǔ)存條件:4℃避光保存
FITC是一種常用的綠色熒光探針。FITC的吸收(激發(fā))和發(fā)射峰參見下表。
Fluorophore Absorption Peak(nm) Emission Peak(nm)
FITC 492 520
當(dāng)FITC在堿性溶液中與抗體蛋白反應(yīng)時(shí),主要是蛋白質(zhì)上賴氨酸的r氨基與熒光素的硫碳胺鍵(thiocarbmide)結(jié)合,形成FITC-蛋白質(zhì)結(jié)合物,即熒光抗體或熒光結(jié)合物。一個(gè)IgG分子中有86個(gè)賴氨酸殘基,一般zui多能結(jié)合15~20個(gè),一個(gè)IgG分子可結(jié)合2~8個(gè)分子的FITC,其反應(yīng)式如下
FITC-N=C=S + N-H2-蛋白質(zhì) → FITC-NS-C-N-H2-蛋白質(zhì)
常用Marsshall(1958)法標(biāo)記熒光抗體,也可以根據(jù)條件采用Chadwick等標(biāo)記法或Clark等(1963)的透析標(biāo)記法。
1.Marsshall法
(1)材料 抗體球蛋白溶液、0.5mol/L(pH9.0)碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光
素、1%硫柳汞水溶液、50ml小燒杯、4℃冰箱、電磁攪拌器、透析袋、玻棒、pH7.2或 3.0的0.01mol/LPBS等。
(2)方法及步驟 ①抗體的準(zhǔn)備 取適量已知濃度的球蛋白溶液于燒杯中,再加人生理鹽水及碳酸鹽緩沖液,使zui后免疫球蛋白濃度為20mg/ml,碳酸鹽緩沖液容量為總量的1/10,混勻,將燒瓴置電磁攪拌器上(速度適當(dāng)以不起泡沫為宜)5~10min。
②熒光素的準(zhǔn)備 根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量,按每毫克免疫球蛋白加0.01mg熒光色素,用分析天平準(zhǔn)確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末。也可用下述公式計(jì)算出免疫球蛋白、熒光素的量,還可以算出需加緩沖液的量。
a.蛋白溶液:含量Amg/m1;容積Bml。
b.總蛋白量(AXB)=Crag。
c.C/20~C/10=Dmg(如蛋白含量低于20mg/ml,用C/10;如高于20mg/ml,用C/20)。
d.熒光素FITC的量:(1/50~2/100)XC=Emg。
e.巳0.5mol/L(pH9.5)碳酸鹽緩沖液D/10=Fml。
f. PBS量D-(B+F)=Gml。
注:A為蛋白含量,mg/ml;B為蛋白質(zhì)溶液的容積;C為蛋白總量,mg;D為常數(shù),mg;正為熒光素的量,mg;F為碳酸鹽緩沖液的容積,ml;G為PBS的容積,ml。
③結(jié)合(或標(biāo)記) 邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中,避免將熒光素粘于燒瓶壁(大約在5—10min內(nèi)加完),加完后,繼續(xù)避光攪拌12h左右。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右,故需將燒杯和攪拌器一起移人4℃冰箱中。
④透析 結(jié)合完畢后,將標(biāo)記的球蛋白溶液離心(2500r/min)20rain,除去其中少量的沉淀物,裝入透析袋中,再置于燒杯中,用pH8.0緩沖鹽水透析(0~4~C)。
⑤過柱 取透析的標(biāo)記物,通過葡聚糖凝膠SephadexG-25或G—50柱,分離游離熒光素,收集標(biāo)記的熒光抗體進(jìn)行鑒定。洗脫液:0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2);過濾量:12ml標(biāo)記蛋白液(過濾前未透析);收集量:20ml(稀釋1.7倍左右)。
2.Chadwick法
(1)試劑和材料 抗體球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%碳酸鈉水溶液、0.01mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、離心機(jī)及離心管、燒杯(25ml)攪拌器、無菌吸管,無菌吸管及毛細(xì)滴管、燒杯(500ml)透析袋等。
(2)方法及步驟 ①抗體準(zhǔn)備 用o~4~C的pH8。0磷酸鹽緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為30~40mg/ml,置入25ml燒杯內(nèi),放于冰槽中。
②熒光色素準(zhǔn)備 按每毫克免疫球蛋白加入熒光素0.01rug計(jì)算,稱取所需的熒光素,用3%碳酸鈉水溶液溶解。
③將準(zhǔn)備的抗體與熒光色素溶液等量混合,充分?jǐn)噭?,在o~4~C冰箱中結(jié)合(在磁力攪拌機(jī)上持續(xù)攪拌)18~24h。
④透析和柱層析 方法同Marsshall法。
3.改良法
(1)試劑和材料 ①0.01mol/L(pH7.2)PBS配法中,校定pH至7.2。NaCi 18g、Na2HP04 1.15g,溶于2000ml蒸餾水
②0.5mol/L(pH9.0)碳酸鹽緩沖液配法 取0.5mol/LNazCOs(5.3%)10ml加入0.5mol/LNaHC03(4.2%)90ml,混合后,校定pH至9.0。
③3%碳酸鈉水溶液配法 稱L 5g無水碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。
④其他試劑和材料 l%*、離心機(jī)及離心管、燒杯(25m1)、攪拌器、無菌吸管及毛細(xì)滴管、燒杯(500m1)透析袋等。
(2)方法及步驟 ①取價(jià)的抗人球蛋白兔免疫血清,分離球蛋白,用鹽水(0.15mol/LNaCl)及緩沖液(0.5mol/LNaHC03—Na2C03,pH9.0)稀釋使每毫升內(nèi)含蛋白質(zhì)lOmg,緩沖液為總量的10%,降溫至4℃。
②加入異硫氰酸鹽(FITC)熒光素[蛋白:熒光素=(50—80)mg‘lmg],在0~4~C
下電磁攪拌12~14h。
③然后用半飽和的硫酸銨將標(biāo)記球蛋白沉淀分離,除去未結(jié)合的熒光素,再用緩沖鹽水透析,除去硫酸銨(用Nessler試劑測(cè)驗(yàn),至隔夜透析的鹽水無氨離子及熒光色素為止)。
④將制備好的熒光抗體加*o.01%,分裝在lml安瓿中,或凍干,保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上,一20~C保存可達(dá)2年以上。
4.透析標(biāo)記法
此法適用于小量抗體的熒光素標(biāo)記,標(biāo)記簡便,非特異性染色較少。
(1)試劑和材料 試劑和材料同改良法。
(2)方法及步驟 ①用0.025mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0,將欲標(biāo)記免疫球蛋白稀釋成1%濃度,裝入透析袋中。
②用同一緩沖液將FITC配成0.1mg/ml的溶液,按10mg/ml球蛋白溶液體積的10倍,將FITC稀釋液盛于圓柱形容器內(nèi),并使透析袋浸沒于FITC液中。
③容器頂端蓋緊,底部放攪拌棒,在4~C電磁攪拌下透析標(biāo)記24h。取出透析袋中標(biāo)記液,即刻用SephadexG50凝膠過濾,去除游離熒光素,分裝,貯存于4℃中。