黃曲霉毒素的檢測方法
1.生物鑒定法 其特點(diǎn)是待檢樣品不需很純,主要用于定性,共有10種:(1)抑菌試驗(yàn);(2)對微生物遺傳因子影響試驗(yàn);(3)細(xì)菌發(fā)光試驗(yàn);(4)熒光反應(yīng);(5)組織培養(yǎng)檢測法;(6)雞胚試驗(yàn);(7)鴨胚試驗(yàn);(8)鱒魚試驗(yàn);(9)植物試驗(yàn);(10)飼喂實(shí)驗(yàn)動物試驗(yàn)。生物鑒定法是利用AFT能影響微生物、水生動物、家禽等生物體的細(xì)胞代謝,來鑒定AFT的存在。其方法專一性差,靈敏度低,一般只作為化學(xué)分析法的佐證。
2.化學(xué)分析法 zui常用的為薄層層析法(TLC),適用于糧食及其制品、調(diào)味品等AFB 1 的檢測,主要是半定量。利用AFB 1 具有熒光性的特點(diǎn),提取和濃縮樣品中的AFB 1 ,用單向或雙向展開法在薄層上分離后,在365nm紫外光照射下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光,根據(jù)在薄層上顯示熒光的zui低檢出量定量,其靈敏度為5μg/kg。由于薄層層析法測定AFB 1 不是很專一,因此樣品中其他熒光物質(zhì)的干擾造成測定誤差??梢杂靡韵路椒ㄟM(jìn)行確定:一是用多種溶劑系統(tǒng)展開,可將AFB 1 、G 1 及各種AFT類似物分開;二是采用層析斑點(diǎn)的化學(xué)試驗(yàn),將樣品提取物用甲酸亞硫酰氨或三氟醋酸處理,用衍生化的方法將AFB 1 與其類似物分開;三是層析斑點(diǎn)的物理試驗(yàn),可根據(jù)紫外吸收光譜,紅外吸收光譜和熒光屏光譜的差別,將非黃曲霉毒素和AFT分開。
3.儀器分析法 液相色譜法(HPLC)是20世紀(jì)70年代初發(fā)展起來的一種以液體為流行相的新型色譜技術(shù)。是分離分析各種AFT的好方法,如配以熒光檢測器,則該法具有靈敏度高、分離能力強(qiáng)、特異性好、測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)。在國外己廣泛地用于食品中AFT的測定。但由于食物樣品成分復(fù)雜,在進(jìn)行液相色譜分離分析前,需對樣品作*的凈化處理。常用的凈化方法是柱色譜法,該法操作繁瑣,且需使用大量有機(jī)溶劑。免疫親和柱作為AFT特異有效的分離凈化和濃縮手段,一出現(xiàn)就和液相色譜法結(jié)合用來測定糧食、飲料、尿、血及奶中的AFT。王光建等 將免疫親和柱的高度特異性和液相色譜法的高分離能力相結(jié)合,所建立的花生和玉米中AFB l 、B 2 、G 1 、G 2 的測定方法,具有雜質(zhì)干擾少、操作簡便、使用有機(jī)溶劑少、靈敏準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),整個分析操作可在15min內(nèi)完成。
4.免疫分析法 這種方法是利用免疫、酶及生化技術(shù),開辟了AFT分析的新領(lǐng)域。目前應(yīng)用的方法有放射免疫法、親和層析法和酶聯(lián)免疫法。(1)放射免疫法。特異性強(qiáng)、靈敏度高、比較準(zhǔn)確迅速、操作簡單、易于標(biāo)準(zhǔn)化。但也有嚴(yán)重的缺點(diǎn),特別是需要持殊的設(shè)備和安全保護(hù),妨礙了更廣泛的應(yīng)用。(2)親和層析法。利用免疫化學(xué)反應(yīng)原理,采用大劑量的單克隆抗體,選擇性吸附提取液中的抗原物質(zhì)-AFT。由于抗原-抗體反應(yīng)具有高靈敏、高選擇、高特異性等特點(diǎn),從而大大提高了試樣的凈化效果及檢測靈敏度,同時可顯著減少有毒有害試劑的使用,十分有利于操作人員的健康和環(huán)境保護(hù)。張藝兵等提出了一種以免疫親和柱凈化結(jié)合熒光光度法檢測AFT的新方法,檢測低限可達(dá)10 -11 ~10 -12 g/ml。20世紀(jì)90年代起,免疫親和技術(shù)在食品分析領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。(3)酶聯(lián)免疫法(ELISA)?;驹硎菍⒖贵w吸附于固相載體上,加入已經(jīng)用酶標(biāo)記的抗原與樣品中的待測物混合物進(jìn)行特異性的免疫反應(yīng),然后再加入酶的底物進(jìn)行顯色反應(yīng),通過顏色的深淡來判斷樣品中待測物的(抗原)含量。酶聯(lián)免疫法大體分為兩類:—是用雙抗體夾心法檢測樣本中的AFT。如Wogan將AFB l 牛血清白蛋白涂于微滴定板池,經(jīng)初步培養(yǎng)后,加兔的APTB 1 抗體和游離APTB 1 用磷酸4—硝基苯酯作基質(zhì)。以堿性磷酸酶—抗兔免疫球蛋白檢測第—抗體的結(jié)合;二是用競爭法檢測樣本中的AFT。如在涂抗體的小孔中,用乙烷萃取的AFB l ,并與結(jié)合了辣根過氧化酶的AFTB 1 混合室溫下10min后,用水洗除去未結(jié)合的黃曲霉共軛物,加底物后在405nm檢測。ELISA法靈敏度高,比薄層法提高了近200~500倍 [1,5] ,特異性強(qiáng),熒光物質(zhì)、色素、結(jié)構(gòu)類似物對結(jié)果無干擾。而且回收率高,準(zhǔn)確性好,提取方法簡單,測定時間僅需2h,可同時檢測幾十份樣品,提高了工效。